体外细胞毒性

体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。

体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。

体外细胞毒性试验目的和意义:

　　目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。

　　意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。

体外细胞毒性试验方法:

　　体外细胞毒性试验具有通用性，可以适用于各种医疗器械和生物材料的评价，GB/16886.5标准不是规定一个单一的试验方法，而是规定一个试验方案，需要在一系列试验步骤中判断，以选出最合适的试验，试验主要分三类：浸提液试验，直接接触试验和间接接触试验（琼脂扩散试验和滤膜扩散试验)。

　　由于医疗器械产品和材料的多样性，植入机体环境中的变异性，与机体相互作用的复杂性等因素，选择郎种方法进行体外细胞毒性评价，不同的试验人员会有不同的选择。当一个评价项目具有多个试验方法时，应考虑试验的原理、灵敏性、可选性、可定量性、重现性、试验材料的适用性及局限性等因素进行选择。

　　例如浸提液法适合检测溶出物的毒性；直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可检测出材料微弱的细胞毒性，间接接触法中的琼脂扩散试验适合于毒性大的大批量材料筛选，滤膜扩散法适合于小分子量毒性材料的评价。

　　以上各种方法因原理不同，各有特点，应根据试验材料本身理化性质、毒性作用强弱及其用途，正确地选择试验方法。

MTT法：

将配制好的1×105/mL细胞悬液接种于96孔板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设至少6孔，每孔接种100uL细胞悬液，置CO2培养箱（含体积分数5%二氧化碳气体）37℃培养24h。

培养24h后弃去原培养液，空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液，供试品组分别加入100uL不同浓度的样品浸提液（100%、75%、50%、25%），置CO2培养箱继续培养24h。

更换培养液24h后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入50uL质量浓度为1mg/mL的MTT溶液，继续培养2h后弃去孔内液体，加入100uL异丙醇，置振荡器上振荡，在酶标仪570nm和650nm波长下测定吸光度，计算相对增殖率（RGR）。

直接接触法:

将已培养 48h～72h 生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配制成密度 1.0×105/mL，接种于直径 35mm 培养皿，每皿 2mL，共 9 皿。置 CO2培养箱 （5%CO2，37℃，＞90%湿度）培养至近汇合单层细胞形成。 

弃去原培养液。加入 2mL 新鲜培养基，在培养皿中央部位的细胞层上轻轻放置一片供试样品，共 3 皿。 同法操作阴性对照、阳性对照各 3 皿。置 CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）继续培养 24h。 

培养结束后，于显微镜下观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，根据以下标准判断试验样品分级，分级大于 2 级时被认为有细胞毒性作用。

琼脂扩散法:

将已培养48h～72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配制成密度1.0×105/mL，接种于直径35mm培养皿，每皿2mL，共9皿。置CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）培养至近汇合单层细胞形成。

弃去器皿中的培养基，将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合,使琼脂最终质量浓度为0.5%～2%,并吸取适宜体积加入至每只培养皿内。细胞培养只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。这种琼脂/培养基的混合物宜为液态,并且温度适合于哺乳动物细胞。加入2mL中性红液并在CO2培养箱孵育30min，孵育后丢弃多余的中性红液，将试验样品的平行试样小心地放在每只培养皿的固化琼脂层上,确保试样覆盖细胞层表面约十分之一，共3皿。同法操作阴性对照、阳性对照各3皿。置CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）继续培养24h。 

培养结束后，将培养皿上的试样小心地从固化琼脂层取下，于显微镜下观察培养皿中细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，根据表1判断试验样品分级，分级大于2级时被认为有细胞毒性作用。